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多国科学家宣布：迄今未能重复韩春雨NgAgo实验结果
原创 2016-07-31 李然 贾小方 赛先生
图片来源：Spectrumnews.org。
特约记者 李然
7月29日，来自澳大利亚、美国、西班牙等国的多位科学家公开表示，无法重复韩春雨NgAgo系统的基因组编辑结果，建议《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)杂志介入，要求韩春雨公开原始数据。
今年5月2日，《自然-生物技术》杂志在线发表了河北科技大学副教授韩春雨题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的论文。媒体报道时称：该项新的基因编辑手段对目前热火朝天的CRISPR技术提出了挑战，具有向导设计制作简便、特异性高、脱靶率低等明显优势，被称为颠覆性的第四代基因编辑技术。
韩春雨论文发表后，在国内外引发强烈关注。特别是在国内，韩春雨受到一些著名科学家和媒体的热捧，甚至被誉为“诺奖级”成果。但此后不久，该事件就陷入持续性争论：有人提出韩春雨的基因组编辑结果无法重复，有人说可以重复但效率低，彼此争论不休、难有定论。
7月29日发长文质疑NgAgo结果的，正是此前曾宣布可以重复该结果的澳大利亚国立大学研究者盖坦·布尔焦(Gaetan Burgio)。
盖坦·布尔焦此前曾称：他能重复出韩春雨实验结果。但是，他在7月29日发长文详细叙述他的实验经历，称：尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝试，但最终发现，NgAgo无法进行基因组编辑。他说：“与此同时，我从我的Twitter帐户、TAGC大会、E-mail、Google讨论群的多次讨论中发现，很多人都尝试着利用韩春雨的实验步骤对人类细胞株、小鼠或斑马鱼进行基因组编辑，但是不论是使用NgAgo的DNA，mRNA还是蛋白质，他们都未能检测到基因组编辑 ”有鉴于此，他呼吁《自然-生物技术》杂志介入，要求韩春雨公开原始数据(《赛先生》已全文翻译此信，见后文)。
澳大利亚国立大学研究者Gaetan Burgio于2016年7月29日在Twitter上的发言，图片来自Twitter截图。
该公开信一出，立即引起了相关领域科学家的关注和讨论。国际转基因技术协会(ISTT)在其Twitter上推送了布尔焦的文章以及数位科学家的实名评论。前普林斯顿大学教授、现就职于美国霍华德休斯医学研究所(HHMI)下属研究机构Janelia Farm的科学家David Stern表示，无法利用NgAgo在果蝇中进行编辑;西班牙科学家Lluis Montoliu称，他们在NgAgo之前就已经利用TtAgo进行了两年的实验，并无法实现基因组编辑。此外，网上传有一封发给国际转基因技术协会会员的群发邮件说：“迄今为止，最重要的信息就是：NgAgo无法在哺乳动物细胞中进行基因编辑。看清楚，不要再浪费你的时间、金钱、人力和课题。如果任何人有任何线索表明Ago可以作为基因编辑器，请务必像盖坦·布尔焦一样分享这些结果。”(But, now, the most important message to convey is: NgAgo does not work for gene editing in mammalian cells. Be aware and do not waste your time, your money, your people and projects. If anyone has any positive hint suggesting Ago is indeed working as a genomic editor, please share the results, for the sake of Open Science, as Gaetan beautifully and most generously did.)这封信与Montoliu博士的若干Twitter内容重合。
美国科学家David Stern于2016年7月29日在Twitter上的发言，图片来自Twitter截图。
多位科学家都认为，《自然-生物技术》杂志应当要求韩春雨公开原始数据和具体实验条件。据悉，几位科学家也在考虑将这些负面实验结果近期投放到生物预发表服务器bioRxiv。
西班牙科学家Lluis Montoliu于2016年7月29日在Twitter上的发言，图片来自Twitter截图。
记者就此采访了国内多所知名大学的从事或一直关注基因编辑领域的科学家，两位要求匿名的科学家表示，他们按照韩春雨论文中介绍的方法做了多次试验，都未能重复出韩春雨的试验结果。据介绍，他们熟知的多位同行也未能重复出韩春雨的试验结果。另一位不愿具名的科学家说，不止一个实验室发现无论体内还是体外实验，无法检测出NgAgo的核酸内切酶活性，“但是如果NgAgo没有活性，怎么会有那么好的编辑效果?”
不过，科学家们都认为，就科研实践来说，对于有争议的结果，需要经过专业途径进行严谨调查。另外，他们也都强调，不论NgAgo的命运如何，小作坊式科研模式在中国还是应该被鼓励，不论归国还是本土的科学家，都应该唯才是举，科研评价不论出身。百花齐放、多元化研究是创新的重要途径。
据业内人士推测，发表韩春雨论文的《自然-生物技术》杂志可能会展开调查，要求作者提供原始数据。
我对于NgAgo的实验经历
作者 Gaetan Burgio
翻译 贾小方
基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术近年来极大改变了我们的实验操作。但是，尽管这个系统高效且价格低廉，它的一个主要局限性在于脱靶效应的发生和PAM识别序列的限制。针对这个系统提出的很多修正方案，目的都是进一步提高效率和特异性，并且避免脱靶效应。近日，一个以细菌NgAgo为基础的有别于CRISPR/ Cas9的新系统被提出。NgAgo是基于DNA的识别系统，不像CRISPR位点那样需要PAM识别序列。识别特异性是由磷酸化的ssDNA提供的。由于它不要求任何克隆或体外转录，因此曾被认为可以作为CRISPR-Cas9的替代方案。
近日，来自中国的韩春雨在《自然-生物技术》杂志上发表了一篇引人瞩目的论文，提出NgAgo作为一个简单的细胞编辑系统。同很多人一样，我也特别有兴趣在我的实验室建立起这个实验体系。最近，已经可以从Addgene获得质粒(plasmid)，这进一步鼓舞了我们开始着手实验，过去一个月我们一直在做这方面的尝试。以下就是我的有关NgAgo实验经验的总结。
对韩的论文结果的重复：
首先，因为我的课题组主要从事基于小鼠受精卵的工作，所以我决定不去重复韩的论文中那些基于人源细胞基因敲除的实验，而是选择我一直以来从事的一个基因(β-spectrin)的敲除。针对这个基因，我在两年半以前就利用CRISPR/ Cas9构建了小鼠敲除品系。一般，要建立一个新的技术，我都是用针对这个基因的一套sgRNA。这些sgRNA工作效果特别好，所以我一般都是利用它们进行技术改良。
我们针对β-spectrin的第一次尝试是把5纳克/微升的NLS-NgAgo-GK质粒混合不同浓度的从IDT购买的5’磷酸化的ssDNA (2.5，25和50纳克/微升)注射到小鼠受精卵里。在把这些混合物对受精卵原核注射以后，我们把它们培养4天进入到囊胚阶段，然后提取DNA进行PCR和桑格测序。
在凝胶电泳上有许多额外的条带：
我们的第一次PCR结果如下(图1)，非常令人激动。它显示在凝胶上有多条额外条带。我最初以为这是基因组编辑的产物，与我用CRISPR/ Cas9时经常看到的结果类似。当时我恰好在TAGC会议，就把这些结果展示给同事们，和几位讨论之后，决定把这些结果发布在我的Twitter上(图1)【译者：这就是最初的关于“澳大利亚研究组重复出韩春雨结果”的来源】。
图1：受精卵原核注射NgAgo之后，基于囊胚的PCR结果。
然后，我们对这些PCR产物进行了T7核酸内切酶检测(图2)，但是非常奇怪，我们看不到与原PCR的明显区别。
图2：对NgAgo注射过的受精卵PCR产物的T7核酸内切酶检测。
有趣的是，当5'磷酸化ssDNA浓度较高时，即使用相同的引物对，这些额外的条带几乎都消失了(见图3)。在用其他基因(Tet1和Tet2)测试时也这样。
图3：当用高浓度5'磷酸化的ssDNA(25纳克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和电泳凝胶。
同时，我从我的Twitter帐户、TAGC大会、E-mail、Google讨论群的多次讨论中发现，很多人都尝试着利用韩春雨的实验步骤对人类细胞株、小鼠或斑马鱼进行基因组编辑，但是不论使用NgAgo的DNA，mRNA或蛋白质，他们都未能检测到基因组编辑。
第一批桑格测序的结果：
然后我们进行了第一轮的桑格测序，结果显得一塌糊涂(图4)，许多等位基因都扩增了，以致于我们不能找出确定的序列。不过，通过与导向序列的匹配，我曾怀疑有2个样品是被编辑了的(来自图1的样品3和8)。
图4：对小鼠囊胚进行NgAgo、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后获得囊胚，进行DNA提取、PCR扩增和测序之后的一个典型测序结果。
第二批桑格测序的结果：
于是，我们又做了一次PCR，并从电泳凝胶上切下每一个额外条带送去做Sanger测序，以确定它们到底是来自质粒、来自编辑之后的β-spectrin，还是引物二聚体。我之前已经在Twitter上或其他地方贴了两条讨论，指出5'磷酸化的ssDNA有可能作为引物扩增基因组。结果在图5中。这些结果证明这些额外的条带来自于随机序列的扩增。
图5：微注射NgAgo的小鼠受精卵凝胶电泳。
我必须加2条重要的评论：1)引物是特异针对目标序列的。我们已经用这些引物做了无数的PCR，但从没见过有这些额外的条带。 2)这些只在低浓度的5'磷酸化ssDNA特定条件下看到，在用25纳克/微升的浓度时几乎不存在。
序列比对：
最初我认为这些序列是随机的，但是不太确定。为了验证这个假设，我使用Clustal软件进行了序列比对，看是否能得到这些序列共有的模式。使用正向引物进行桑格测序的结果如图6所示。使用反向引物的测序结果差不多，这里我没有展示。
图6:代表性的所有电泳胶的序列的Clustal比对。Ank-1作为参考序列。
这显然有一个共有的序列模式，但和所有的5’磷酸化ssDNA都不匹配。然而它和正向和反向引物不完美地匹配，我一会再讨论这一点。我能想到的假设是，我的引物是非特异的，可是这个假设不能解释：1)为什么用25纳克/微升的5’磷酸化ssDNA时就看不到这个模式;2)因为我已经用这些引物对超过100个CRISPR/Cas9编辑的老鼠进行基因型鉴定和桑格测序，那么我之前应该早就看到这个现象，3)最初的PCR(图1，2和3)里，B6(C57BL/6) DNA和水对照都没有这些多余的条带。
为了进一步研究这一点，我假设外源DNA序列(质粒或者别的来自小鼠基因组的核酸)整合进了扩增序列。为了验证这一点，我检查了小鼠基因组序列和从胶上切下来的引物对片段序列。如图7所示一个例子。我在正向和反向引物中都发现了相同的序列模式。
图7: 一个代表性测序色谱图(使用反向引物测序)。
图7说明两个特点。一，正向和反向引物的最前面6到9个核酸和内源序列完美匹配。二，来自引物对的剩下的13到16个核酸被添加到了内源序列。这解释了胶上的扩增出的多余条带(图1)。这些引物对没有磷酸化， PCR和测序反应也没有加连接酶。
NgAgo是一个连接酶?
从这些结果，我得出如下假说：NgAgo质粒被注射进受精卵之后，可能在合子阶段被转录并翻译成蛋白质。这个NgAgo酶在37 ºC条件下当然可以一直存在到囊胚阶段，并且在分离囊胚DNA的时候未受破坏。PCR反应显然激活了NgAgo，使其在通常的PCR条件下作为“连接酶”，把10到15个核苷酸添加到内源序列上，并且前6到10个核苷酸能和引物对匹配。有意思的是，这种NgAgo的“连接酶”活性似乎能被高浓度的5’磷酸化ssDNA抑制。我的推测是可能NgAgo被其降解了。
我关于NgAgo如何起作用的假说：
这是我经过一系列实验后关于NgAgo的一些想法。首先，像很多人一样，多次尝试后，我仍旧没有发现任何证据证明NgAgo能进行基因组编辑。可是，在通常的PCR条件下，我竟然发现NgAgo有类似“连接酶”的活性，而这与韩的文章里所说的内切酶活性没有半点关系。在我看来，NgAgo似乎需要超过50 ºC才能发挥作用，这和韩的文章有直接矛盾。
总结所有这些试图重复韩的文章但失败的实验，我认为是由于细胞所处的温度对于NgAgo发挥作用太低了，或者NgAgo或5’磷酸化ssDNA与NgAgo复合物在细胞内被快速降解了，这可能也是为什么没有人能重复韩的实验。NgAgo可能没有：或者只在严格限定的条件下才有内切酶活性，从而使得它几乎不可能被重复；即使它真有活性，也限制了它的广泛应用。此外，我对NgAgo是否真有内切酶活性很怀疑。《自然-生物技术》应该要求韩向公众公开他所有的原始数据和实验条件，这是学术期刊的义务。最后，我强烈相信，不管NgAgo怎样，CRISPR/Cas9系统将长期存在，而NgAgo经过那么多失败的尝试后将被很快遗忘。显然，NgAgo尚没有一个光明的未来。
我对开放科学的观点：
最后，我想以感谢我实验室所有人、推特和别的地方参与讨论这个故事的人结束我的文章。这是我第一次参与开放科学的体验，并且感到和同伴们的讨论富有启发性。我认为与其追逐发表高影响因子的文章并且神神秘秘，我们应该开放和分享我们的结果，以帮助每个人都避免在不可重复和没有意义的实验上浪费时间。在我看来，科学应该以这种方式进行。
英文原文标题
My experience with Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo)。
原文链接
https://medium.com/@GaetanBurgio/my...goryi-argonaute-ngago-3ed8909b410c#.hl7vlhia6)
延伸阅读
韩春雨：我的基因编辑系统还只是“手动档”
投稿、授权等请联系：iscientists@126.com
您可回复"年份+月份"（如201510），获取指定年月文章，或返回主页点击子菜单获取或搜索往期文章。
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赛先生由百人传媒投资和创办，文小刚、刘克峰、颜宁三位国际著名科学家担任主编，告诉你正在发生的科学。上帝忘了给我们翅膀，于是，科学家带领我们飞翔。
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韩佳鹏.亿欧
啊啊啊，外国人在最后一段说得好，一语中的。中国科学家缺这种气质
15分钟前
5
YWFang
真理愈辯愈明！文章中提到了不能對本土研究人員歧視，這是中國政府和科學界要正視的！
19分钟前
4
青岩
逐渐演变为闹剧
19分钟前
2
gaohongxin
大半夜的，搞大新闻啊！
31分钟前
Elaine
我认为与其追逐发表高影响因子的文章并且神神秘秘，我们应该开放和分享我们的结果，以帮助每个人都避免在不可重复和没有意义的实验上浪费时间。在我看来，科学应该以这种方式进行。
6分钟前
陌上隰桑
小编辛苦了，静待专业人士的结果和结论
8分钟前
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多国科学家宣布：迄今未能重复韩春雨NgAgo实验结果
原创 2016-07-31 李然 贾小方 赛先生
图片来源：Spectrumnews.org。
特约记者 李然
7月29日，来自澳大利亚、美国、西班牙等国的多位科学家公开表示，无法重复韩春雨NgAgo系统的基因组编辑结果，建议《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)杂志介入，要求韩春雨公开原始数据。
今年5月2日，《自然-生物技术》杂志在线发表了河北科技大学副教授韩春雨题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的论文。媒体报道时称：该项新的基因编辑手段对目前热火朝天的CRISPR技术提出了挑战，具有向导设计制作简便、特异性高、脱靶率低等明显优势，被称为颠覆性的第四代基因编辑技术。
韩春雨论文发表后，在国内外引发强烈关注。特别是在国内，韩春雨受到一些著名科学家和媒体的热捧，甚至被誉为“诺奖级”成果。但此后不久，该事件就陷入持续性争论：有人提出韩春雨的基因组编辑结果无法重复，有人说可以重复但效率低，彼此争论不休、难有定论。
7月29日发长文质疑NgAgo结果的，正是此前曾宣布可以重复该结果的澳大利亚国立大学研究者盖坦·布尔焦(Gaetan Burgio)。
盖坦·布尔焦此前曾称：他能重复出韩春雨实验结果。但是，他在7月29日发长文详细叙述他的实验经历，称：尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝试，但最终发现，NgAgo无法进行基因组编辑。他说：“与此同时，我从我的Twitter帐户、TAGC大会、E-mail、Google讨论群的多次讨论中发现，很多人都尝试着利用韩春雨的实验步骤对人类细胞株、小鼠或斑马鱼进行基因组编辑，但是不论是使用NgAgo的DNA，mRNA还是蛋白质，他们都未能检测到基因组编辑 ”有鉴于此，他呼吁《自然-生物技术》杂志介入，要求韩春雨公开原始数据(《赛先生》已全文翻译此信，见后文)。
澳大利亚国立大学研究者Gaetan Burgio于2016年7月29日在Twitter上的发言，图片来自Twitter截图。
该公开信一出，立即引起了相关领域科学家的关注和讨论。国际转基因技术协会(ISTT)在其Twitter上推送了布尔焦的文章以及数位科学家的实名评论。前普林斯顿大学教授、现就职于美国霍华德休斯医学研究所(HHMI)下属研究机构Janelia Farm的科学家David Stern表示，无法利用NgAgo在果蝇中进行编辑;西班牙科学家Lluis Montoliu称，他们在NgAgo之前就已经利用TtAgo进行了两年的实验，并无法实现基因组编辑。此外，网上传有一封发给国际转基因技术协会会员的群发邮件说：“迄今为止，最重要的信息就是：NgAgo无法在哺乳动物细胞中进行基因编辑。看清楚，不要再浪费你的时间、金钱、人力和课题。如果任何人有任何线索表明Ago可以作为基因编辑器，请务必像盖坦·布尔焦一样分享这些结果。”(But, now, the most important message to convey is: NgAgo does not work for gene editing in mammalian cells. Be aware and do not waste your time, your money, your people and projects. If anyone has any positive hint suggesting Ago is indeed working as a genomic editor, please share the results, for the sake of Open Science, as Gaetan beautifully and most generously did.)这封信与Montoliu博士的若干Twitter内容重合。
美国科学家David Stern于2016年7月29日在Twitter上的发言，图片来自Twitter截图。
多位科学家都认为，《自然-生物技术》杂志应当要求韩春雨公开原始数据和具体实验条件。据悉，几位科学家也在考虑将这些负面实验结果近期投放到生物预发表服务器bioRxiv。
西班牙科学家Lluis Montoliu于2016年7月29日在Twitter上的发言，图片来自Twitter截图。
记者就此采访了国内多所知名大学的从事或一直关注基因编辑领域的科学家，两位要求匿名的科学家表示，他们按照韩春雨论文中介绍的方法做了多次试验，都未能重复出韩春雨的试验结果。据介绍，他们熟知的多位同行也未能重复出韩春雨的试验结果。另一位不愿具名的科学家说，不止一个实验室发现无论体内还是体外实验，无法检测出NgAgo的核酸内切酶活性，“但是如果NgAgo没有活性，怎么会有那么好的编辑效果?”
不过，科学家们都认为，就科研实践来说，对于有争议的结果，需要经过专业途径进行严谨调查。另外，他们也都强调，不论NgAgo的命运如何，小作坊式科研模式在中国还是应该被鼓励，不论归国还是本土的科学家，都应该唯才是举，科研评价不论出身。百花齐放、多元化研究是创新的重要途径。
据业内人士推测，发表韩春雨论文的《自然-生物技术》杂志可能会展开调查，要求作者提供原始数据。
我对于NgAgo的实验经历
作者 Gaetan Burgio
翻译 贾小方
基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术近年来极大改变了我们的实验操作。但是，尽管这个系统高效且价格低廉，它的一个主要局限性在于脱靶效应的发生和PAM识别序列的限制。针对这个系统提出的很多修正方案，目的都是进一步提高效率和特异性，并且避免脱靶效应。近日，一个以细菌NgAgo为基础的有别于CRISPR/ Cas9的新系统被提出。NgAgo是基于DNA的识别系统，不像CRISPR位点那样需要PAM识别序列。识别特异性是由磷酸化的ssDNA提供的。由于它不要求任何克隆或体外转录，因此曾被认为可以作为CRISPR-Cas9的替代方案。
近日，来自中国的韩春雨在《自然-生物技术》杂志上发表了一篇引人瞩目的论文，提出NgAgo作为一个简单的细胞编辑系统。同很多人一样，我也特别有兴趣在我的实验室建立起这个实验体系。最近，已经可以从Addgene获得质粒(plasmid)，这进一步鼓舞了我们开始着手实验，过去一个月我们一直在做这方面的尝试。以下就是我的有关NgAgo实验经验的总结。
对韩的论文结果的重复：
首先，因为我的课题组主要从事基于小鼠受精卵的工作，所以我决定不去重复韩的论文中那些基于人源细胞基因敲除的实验，而是选择我一直以来从事的一个基因(β-spectrin)的敲除。针对这个基因，我在两年半以前就利用CRISPR/ Cas9构建了小鼠敲除品系。一般，要建立一个新的技术，我都是用针对这个基因的一套sgRNA。这些sgRNA工作效果特别好，所以我一般都是利用它们进行技术改良。
我们针对β-spectrin的第一次尝试是把5纳克/微升的NLS-NgAgo-GK质粒混合不同浓度的从IDT购买的5’磷酸化的ssDNA (2.5，25和50纳克/微升)注射到小鼠受精卵里。在把这些混合物对受精卵原核注射以后，我们把它们培养4天进入到囊胚阶段，然后提取DNA进行PCR和桑格测序。
在凝胶电泳上有许多额外的条带：
我们的第一次PCR结果如下(图1)，非常令人激动。它显示在凝胶上有多条额外条带。我最初以为这是基因组编辑的产物，与我用CRISPR/ Cas9时经常看到的结果类似。当时我恰好在TAGC会议，就把这些结果展示给同事们，和几位讨论之后，决定把这些结果发布在我的Twitter上(图1)【译者：这就是最初的关于“澳大利亚研究组重复出韩春雨结果”的来源】。
图1：受精卵原核注射NgAgo之后，基于囊胚的PCR结果。
然后，我们对这些PCR产物进行了T7核酸内切酶检测(图2)，但是非常奇怪，我们看不到与原PCR的明显区别。
图2：对NgAgo注射过的受精卵PCR产物的T7核酸内切酶检测。
有趣的是，当5'磷酸化ssDNA浓度较高时，即使用相同的引物对，这些额外的条带几乎都消失了(见图3)。在用其他基因(Tet1和Tet2)测试时也这样。
图3：当用高浓度5'磷酸化的ssDNA(25纳克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和电泳凝胶。
同时，我从我的Twitter帐户、TAGC大会、E-mail、Google讨论群的多次讨论中发现，很多人都尝试着利用韩春雨的实验步骤对人类细胞株、小鼠或斑马鱼进行基因组编辑，但是不论使用NgAgo的DNA，mRNA或蛋白质，他们都未能检测到基因组编辑。
第一批桑格测序的结果：
然后我们进行了第一轮的桑格测序，结果显得一塌糊涂(图4)，许多等位基因都扩增了，以致于我们不能找出确定的序列。不过，通过与导向序列的匹配，我曾怀疑有2个样品是被编辑了的(来自图1的样品3和8)。
图4：对小鼠囊胚进行NgAgo、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后获得囊胚，进行DNA提取、PCR扩增和测序之后的一个典型测序结果。
第二批桑格测序的结果：
于是，我们又做了一次PCR，并从电泳凝胶上切下每一个额外条带送去做Sanger测序，以确定它们到底是来自质粒、来自编辑之后的β-spectrin，还是引物二聚体。我之前已经在Twitter上或其他地方贴了两条讨论，指出5'磷酸化的ssDNA有可能作为引物扩增基因组。结果在图5中。这些结果证明这些额外的条带来自于随机序列的扩增。
图5：微注射NgAgo的小鼠受精卵凝胶电泳。
我必须加2条重要的评论：1)引物是特异针对目标序列的。我们已经用这些引物做了无数的PCR，但从没见过有这些额外的条带。 2)这些只在低浓度的5'磷酸化ssDNA特定条件下看到，在用25纳克/微升的浓度时几乎不存在。
序列比对：
最初我认为这些序列是随机的，但是不太确定。为了验证这个假设，我使用Clustal软件进行了序列比对，看是否能得到这些序列共有的模式。使用正向引物进行桑格测序的结果如图6所示。使用反向引物的测序结果差不多，这里我没有展示。
图6:代表性的所有电泳胶的序列的Clustal比对。Ank-1作为参考序列。
这显然有一个共有的序列模式，但和所有的5’磷酸化ssDNA都不匹配。然而它和正向和反向引物不完美地匹配，我一会再讨论这一点。我能想到的假设是，我的引物是非特异的，可是这个假设不能解释：1)为什么用25纳克/微升的5’磷酸化ssDNA时就看不到这个模式;2)因为我已经用这些引物对超过100个CRISPR/Cas9编辑的老鼠进行基因型鉴定和桑格测序，那么我之前应该早就看到这个现象，3)最初的PCR(图1，2和3)里，B6(C57BL/6) DNA和水对照都没有这些多余的条带。
为了进一步研究这一点，我假设外源DNA序列(质粒或者别的来自小鼠基因组的核酸)整合进了扩增序列。为了验证这一点，我检查了小鼠基因组序列和从胶上切下来的引物对片段序列。如图7所示一个例子。我在正向和反向引物中都发现了相同的序列模式。
图7: 一个代表性测序色谱图(使用反向引物测序)。
图7说明两个特点。一，正向和反向引物的最前面6到9个核酸和内源序列完美匹配。二，来自引物对的剩下的13到16个核酸被添加到了内源序列。这解释了胶上的扩增出的多余条带(图1)。这些引物对没有磷酸化， PCR和测序反应也没有加连接酶。
NgAgo是一个连接酶?
从这些结果，我得出如下假说：NgAgo质粒被注射进受精卵之后，可能在合子阶段被转录并翻译成蛋白质。这个NgAgo酶在37 ºC条件下当然可以一直存在到囊胚阶段，并且在分离囊胚DNA的时候未受破坏。PCR反应显然激活了NgAgo，使其在通常的PCR条件下作为“连接酶”，把10到15个核苷酸添加到内源序列上，并且前6到10个核苷酸能和引物对匹配。有意思的是，这种NgAgo的“连接酶”活性似乎能被高浓度的5’磷酸化ssDNA抑制。我的推测是可能NgAgo被其降解了。
我关于NgAgo如何起作用的假说：
这是我经过一系列实验后关于NgAgo的一些想法。首先，像很多人一样，多次尝试后，我仍旧没有发现任何证据证明NgAgo能进行基因组编辑。可是，在通常的PCR条件下，我竟然发现NgAgo有类似“连接酶”的活性，而这与韩的文章里所说的内切酶活性没有半点关系。在我看来，NgAgo似乎需要超过50 ºC才能发挥作用，这和韩的文章有直接矛盾。
总结所有这些试图重复韩的文章但失败的实验，我认为是由于细胞所处的温度对于NgAgo发挥作用太低了，或者NgAgo或5’磷酸化ssDNA与NgAgo复合物在细胞内被快速降解了，这可能也是为什么没有人能重复韩的实验。NgAgo可能没有：或者只在严格限定的条件下才有内切酶活性，从而使得它几乎不可能被重复；即使它真有活性，也限制了它的广泛应用。此外，我对NgAgo是否真有内切酶活性很怀疑。《自然-生物技术》应该要求韩向公众公开他所有的原始数据和实验条件，这是学术期刊的义务。最后，我强烈相信，不管NgAgo怎样，CRISPR/Cas9系统将长期存在，而NgAgo经过那么多失败的尝试后将被很快遗忘。显然，NgAgo尚没有一个光明的未来。
我对开放科学的观点：
最后，我想以感谢我实验室所有人、推特和别的地方参与讨论这个故事的人结束我的文章。这是我第一次参与开放科学的体验，并且感到和同伴们的讨论富有启发性。我认为与其追逐发表高影响因子的文章并且神神秘秘，我们应该开放和分享我们的结果，以帮助每个人都避免在不可重复和没有意义的实验上浪费时间。在我看来，科学应该以这种方式进行。
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