管轶团队最新研究：穿山甲或为新冠病毒中间宿主之一
2020年02月20日 17:17 来源于
财新网
受体结合域相似度97%；但不排除这样一种可能，即穿山甲是独立于蝙蝠或其他动物宿主，而感染了和新冠病毒相似的病毒
资料图：马来亚穿山甲。
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【财新网】（记者 徐路易 杜偲偲）对于新冠病毒潜在中间宿主的研究又有新进展。
2月19日，汕头大学粤港新发传染病联合实验室、香港大学新发传染性疾病国家重点实验室、广西医科大学胡艳玲课题组等在预印本网站bioRxiv上联合发布的最新研究表明，从华南地区走私穿山甲的多个样品中，发现了和新冠病毒相似的冠状病毒，尤其是在冠状病毒受体结合域（RBD），穿山甲样本中的冠状病毒与新冠病毒相似度达97%。
该论文题为“中国南方马来穿山甲2019-nCoV相关冠状病毒的鉴定”（Identification of 2019-nCoV related coronaviruses in Malayan pangolins in southern China），香港大学新发传染性疾病国家重点实验室主任以及流感研究中心主任
管轶为该论文的通讯作者，广西医科大学生命科学研究院研究员胡艳玲为共同通讯作者。该论文尚未经过正式同行评议。
中间宿主是指天然不携带某种病原体，但是可以被天然宿主携带的病原体感染，并可以向其他物种传播病原体的宿主。此前的2月7日，华南农业大学沈永义、肖立华教授的研究团队曾召开发布会称，他们发现所获得的穿山甲样品中β属冠状病毒的阳性率为70%，电镜下观察到冠状病毒颗粒结构，宏基因组拼接出来的穿山甲病毒序列与目前感染人的毒株序列相似度高达99%，穿山甲可能是新冠病毒的“潜在中间宿主”。（参见财新网报道“
研究称穿山甲为新冠潜在中间宿主 专家认为需更多证据” ）
样本来自走私马来亚穿山甲
上述汕头大学、香港大学和广西医科大学的联合研究团队一共研究了两组穿山甲样本，同时介绍了来自广州海关技术中心在疫情爆发后检测的一组穿山甲样本。第一组样本来自18个穿山甲的43个冷冻组织样本，这其中包括肺、肠和血液。
这些穿山甲是一种分布于东南亚的马来亚穿山甲（Manis javanica，又名爪哇穿山甲），广西海关于2017年8月-2018年1月缴获。RNA高通量测序显示，在这43个样本中，有6个存在冠状病毒：2个阳性结果在肺部样本中检出，2个在肠，1个在血液，1个在肺-肠混合物中。
研究团队发现，上述6个样本中的冠状病毒完整基因组序列，均属于新冠病毒谱系，和新冠病毒有类似的基因组结构。基于这些基因组序列，研究人员设计了实时荧光PCR检测的引物探针。这与人们获得人体内新冠病毒完整基因组序列后设计核酸检测的方式相同。
设计出PCR探针后，研究团队又对另一组于2018年5月至7月广西医科大学取样的12只走私穿山甲的19个样本（9个肠道组织、10个肺组织）进行了核酸检测，发现3个肺组织样本呈阳性。
论文中还提到，新冠疫情暴发后，广州海关技术中心重新检查了于2019年3月反走私行动中获得的5个穿山甲样本（2个皮肤拭子，1个不明组织，1个鳞片），发现在鳞片样本中含有冠状病毒的读数约占新冠病毒基因组的72%。论文提示，2019年在广东进行的另一项关于患病穿山甲的研究中，也在穿山甲的肺部样本里发现了与新冠病毒相似的病毒群。
研究团队发现，这些穿山甲样本中的冠状病毒基因组与新冠病毒的相似度约在85.5%-92.4%，可能代表了进化树中新冠病毒的两个亚型。值得注意的是，中科院武汉病毒所石正丽团队此前发表的研究表明，新冠病毒与云南菊头蝠中存在的RaTG13冠状病毒一致性高达96%。
但最新的研究发现，在冠状病毒受体结合域，新冠病毒与广东穿山甲体内的冠状病毒在氨基酸序列上具有很高的相似性，达到97.4% ，而蝙蝠冠状病毒RaTG13和人类新冠病毒只有89.2% 的氨基酸相似性。但新冠病毒基因组的其余部分仍与蝙蝠冠状病毒RaTG13最相似。
受体结合域（receptor binding domain， RBD）是病毒表面蛋白用来与受体结合的部分。病毒通过它去和人体内细胞上的受体（receptor）结合，比如，非典冠状病毒（SARS-CoV）的RBD就定位在其表面刺突蛋白的第319到510位氨基酸（AA319-510）。
论文还提到，目前为止，除了蝙蝠以外，哺乳动物中只有穿山甲被实际检测出感染与新冠病毒相似的冠状病毒。而在穿山甲中发现了2个相关的冠状病毒谱系，这2个冠状病毒的谱系都与新冠病毒有关。这表明穿山甲可能是这些冠状病毒的长期宿主。
这让研究团队感到不解，因为穿山甲是独居动物，且在多地被列为濒危物种，种群数量相对较小。研究团队提示，不能排除一种可能性，那就是穿山甲独立于蝙蝠或其他动物宿主，而获得了与新冠病毒有关的病毒。
一名共同作者告诉财新记者，有可能是“趋同进化”，通俗而言，即两个独立进化的东西，在类似的选择压力下，演化出了类似的蛋白、类似的功能。”
研究团队提到，穿山甲冠状病毒中发现的两个谱系均来自走私的马来西亚穿山甲，而在这些动物的自然栖息地地区，人们对动物的病毒多样性认识甚少。因此，穿山甲群体中病毒传播的程度尚待调查，但广西和广东反复发生穿山甲冠状病毒感染的情况表明，穿山甲可能是新冠病毒出现的潜在重要宿主。
研究最后强调，包括新冠病毒在内的冠状病毒，在亚洲的许多野生哺乳动物中都存在。为了进一步了解穿山甲体内冠状病毒对新冠病毒出现的影响，以及未来这类人畜共患病传播的风险，非常需要对中国和东南亚自然环境中的穿山甲进行进一步监测。
上述共同作者认为，穿山甲可能是新冠病毒的中间宿主之一。“但穿山甲中已发现的那些冠状病毒，肯定不能等同于新冠病毒。”
尚不确定的病毒进化线路
美国宾夕法尼亚大学医学院副研究员李懿泽告诉财新记者，这一研究说明了新冠病毒的RBD可能来源于穿山甲体内的冠状病毒，但不能说明穿山甲就是新冠病毒从蝙蝠到人类的中间宿主，还有很多问题需要解答。
美国俄亥俄州立大学病毒与新发病原学中心主任刘善虑对《知识分子》解释道，在病毒膜蛋白的受体结合区域，新冠病毒与来自广东的穿山甲冠状病毒有超过97%的同源性，这个数字超过任何一株目前已知的冠状病毒，包括武汉病毒所最近分离的蝙蝠病毒RaTG13。这在进化上提示，穿山甲冠状病毒在这个区域重要氨基酸变化是特意选择的结果，而不是随机的，其目的就是能更高效结合人的受体ACE2，从而达到传染人和在人群中传播的目的。他推测，新冠病毒可能是穿山甲病毒与人的某些冠状病毒的重组体。它可能在进化上结合了SARS和MERS病毒的某些优点，进而显得更胜一筹。
香港大学李嘉诚医学院教授金冬雁评论上述研究说：“很有意思，有提示性，但并没有明确结论说明三种病毒的进化路线。不能说SARS-CoV-2一定来自穿山甲，只能说穿山甲中有类似的病毒。”
一名不愿具名的美国生物学者2月20日向财新记者解释说，通俗而言，从DNA上看，穿山甲里的冠状病毒没有蝙蝠的RaTG13跟新冠的亲缘关系近，所以应该不是从现在发现的穿山甲体内的病毒直接“跳到”人体，但要想确定穿山甲是直接的唯一的中间宿主必须找到那个夹在新冠和RaTG13之间的那个病毒。
但是光看与ACE2相互结合的那一小段结构域的氨基酸序列的话，穿山甲的病毒比RaTG13更像新冠病毒。可是那一段氨基酸是在整个冠状病毒群体里都非常容易突变的，而且也会被持续的自然选择塑造的更容易入侵宿主。“确实相似，但是否同源并不确定”。
除这一研究外，近日还有其他研究者也公开了以穿山甲为宿主的冠状病毒数据。根据全球共享流感病毒数据库GISAID信息，华南农业大学沈永义、肖立华团队，与北京微生物与流行病研究所、香港大学的研究团队2月18-19日也在该平台公开了几组以穿山甲为宿主的冠状病毒基因序列。多位研究者告诉财新记者，从这些数据看来，现在仍不能认定穿山甲是新冠病毒的中间宿主。
斯克里普斯研究所的免疫学家和计算生物学家安德森（Kristian G. Andersen）2月19日告诉财新记者，他快速浏览了所有新的来自穿山甲的冠状病毒序列，他认为这些病毒与新冠病毒很不一样（quite different），与来自蝙蝠的RaTG13病毒相比，来自穿山甲的病毒跟新冠病毒的差异更大。“穿山甲仍有可能是中间宿主，但是数据更显示它们不是中间宿主。”
而GISAID的病毒进化树也显示，华南农业大学研究团队公开的穿山甲冠状病毒基因序列处在RaTG13病毒、新冠病毒之外的分支，而RaTG13病毒与新冠病毒的亲缘关系更为接近。RaTG13病毒于2013年从云南菊头蝠分离得来，是目前已知与新冠病毒的基因序列相似性最高的病毒，达96.3%。
哥伦比亚大学免疫与感染研究中心高级生物信息研究员郭城2月19日也向财新记者表示，“现在还没有完全确凿的证据认定，穿山甲是SARS-CoV-2的直接中间宿主，如果将来找到了基因相似度更高的物种携带的病毒（接近100%），则可以基本确定从该物种到人类的病毒的直接传播。”
当年研究人员从野生动物市场上的果子狸体内检测到的SARS冠状病毒，与人群中流行的 SARS 病毒全基因组序列的一致性达到99.8%。研究者确认，果子狸很可能是将SARS病毒传播给人类的直接源头。
北京微生物与流行病研究所、香港大学的研究人员2月18日也在GISAID发布了5组以穿山甲为宿主的冠状病毒基因序列，其中一组样本来自广东，其余4组来自广西。来自广东的毒株的基因序列与华南农业大学发布的毒株序列处在进化树的同一分支，来自广西的样本与新冠病毒亲缘关系较远。
这一数据库的管理者、美国华盛顿大学医学系和基因组科学系副教授、Fred Hutchinson癌症研究中心的生物信息学专家Trevor Bedford在推特上表示，“两个团队似乎都可能用了在广东查获的同种动物进行研究。这些与穿山甲相关的SARS样冠状病毒的相似性使穿山甲成为新冠病毒的合理中间宿主，但这尚不确定。”
确定中间宿主需严格流程
当一种新显病毒引起疫情流行暴发时，为切断传染途径，需要搞清楚病毒从哪里来。1月23日，中国科学院武汉病毒研究所研究员石正丽团队在bioRxiv预印版平台上发表文章“一种新冠病毒的发现及其可能的蝙蝠起源”。该研究表明，新冠病毒与SARS-CoV的基因序列一致性达79.5%，与云南菊头蝠中存在的RaTG13冠状病毒一致性高达96%。这表明其自然宿主很有可能是蝙蝠（参见财新周刊封面报道“
新冠病毒何以至此”之三：溯源新冠病毒）。
但对疫情防控来说，更为重要的是找到新冠病毒的中间宿主究竟是哪种动物，只有找到它才能切断源头，防止病毒再传染给人。但确定中间宿主需经过复杂而严格的实验流程。2003年SARS疫情期间，管轶实验室曾成功确定了冠状病毒是SARS肺炎的病原体，之后他们又追踪到SARS冠状病毒的传染源来自于城市畜禽市场中的野生动物果子狸。根据管轶2013年的口述，寻找SARS中间宿主的过程中，他们曾前往深圳市东门市场去做野生动物取样，共取了8种动物的25个标本。拿回去研究时，他要求每个标本设三对码，代表头、体和尾，只有三对码的结果都是阳性的才能挑出来作为备选。这样做的理由是，病毒在传播中并不知道哪个动物喜欢它，哪个动物不喜欢它，因此有的动物虽然感染了病毒，但病毒不能完成复制，只有一部分存留。只有三对码结果全部为阳性，才能证明病毒已经很好地完成了复制。
中科院一位生物信息学领域的研究员此前告诉财新记者，目前信息可以支持将穿山甲作为新冠病毒的中间宿主之一，但要确定穿山甲是将新冠病毒直接传染给人的中间宿主，还需要流行病学调查提供真实的临床传播的证据。“得有真正的穿山甲的接触史才行，就说真的有一个人碰了穿山甲，这个穿山甲序列也拿到了。当年SARS的时候，就是得病的人和他碰到的市场里的果子狸都分离出来病毒进行比对，就是要有真实的接触史。”
研究族群遗传学及基因体学的台湾大学临床医学研究所教授王弘毅也对财新记者指出，要判断穿山甲是否是潜在的中间宿主，需要确定这个病毒是否可以同时感染人类以及穿山甲。如果确定是从穿山甲取出的，那要先看这只动物的疾病情形，“是否发病？或是症状如何？另外也要针对人类细胞做研究，确认是否可以感染人体细胞。至少可以依据序列预测病毒结构，与已知的人类受体是否能够结合等。”
“很不幸，因为华南海鲜市场在疫情爆发之后很快被清理，因此锁定野生动物传染源极具挑战。”最新的论文说道。1月23日晚，中国科学院院士、中国疾病预防控制中心主任高福接受央视新闻“新闻1+1”节目采访时表示，工作人员已找到病毒基因组，从环境样本里分离出病毒。证据确凿，病源非常清晰是野生动物，但由于市场关了，并不清楚是哪种
